本作是为了纪念在1996年起开始的《游戏王》系列漫画连载二十周年所推出的动画电影。

半空之中，漂浮着闪烁着多彩光芒的“知识之箱”，那里面藏着数不尽的世界、时间和人类。杜娅尔（种田梨沙 配音）与多萝茜（佐仓绫音 配音）穿梭于“知识之箱”之中，与侵蚀各个世界的病毒作战。凡是被病毒污染的世界，必须尽快予以消除。某天，两人感觉到新病毒的出现，她们赶了过去，结果发现遭到病毒袭击的少女莉莫（花守由美里 配音）。少女失去了记忆，只知晓性命，她说出的第一句话关系着所有人的命运…

　本作はTVスペシャルとしては初めてTVシリーズからの素材流用を行っており、第4シリーズの準レギュラーである少女富豪レベッカ・ロッセリーニとMI-6のニクスが初登場した第1話「ルパン三世の結婚」と第3話「生存率0,2％」を流用することでTVシリーズを見ていない視聴者に彼らを紹介し、さらに新作パートを追加することで本作オリジナルの仮面伯爵と名乗る人物とルパン三世の「カリオストロ伯爵の遺産」を巡る心理戦・争奪戦を描いている。このため、キャラクターデザインや作風は第4シリーズとまったく同じとなっている。
　　サブタイトルの「イタリアン・ゲーム」はチェスの序盤定跡の名称であり、イタリアを舞台としていることと、仮面伯爵が「遺産」を巡る各勢力をチェスの駒に例えたことによる。なお、本作のターゲットとなる遺産を残した「カリオストロ伯爵」は18世紀のヨーロッパに実在したアレッサンドロ・ディ・カリオストロであり、1979年公開の劇場映画第2作『ルパン三世 カリオストロの城』の敵役として登場したラザール・ド・カリオストロではない。

　　牙鬼との激闘から2年、それぞれの夢に向かって旅立った6人は好天の三回忌をきっかけに再び忍術道場に集まった。そこへ突如現れた牙鬼の残党を相手にお互い成長した姿を見せ合うように妖怪を倒していく天晴達。中でもガシャドクロを生身で倒してしまう風花と霞の成長に驚く一同。なんとこの2年、2人は強さと人気を兼ね備えたアイドル忍者“ニンニンガールズ"として平和を守っていたのだった!
　　戦いを終え久々の再会を喜ぶ6人の前に「久しぶりね天晴」とまさかの人物、天晴と風花の母・桜子が現れた。しかも風花と霞を誘い“ニンニンガールズ"をプロデュースしているというのだ。さらに世界進出を考える桜子から“伊賀崎流"の名前をかけて“ニンニンガールズ"と真剣勝負を提案される天晴、八雲、凪、キンジの4人は“ニンニンボーイズ"として受けて立つこととなった。この試合もアピールの場として使おうとする桜子は、新メンバー・九重ルナの加入をサプライズ発表。さらにミドニンジャーシュリケンを勝手に与える暴走っぷり。そして数合わせとして旋風も加わり4対4の真剣勝負が始まった。
　　時を同じくして、執念の復活を遂げた有明の方が萬月の復活と、真剣勝負を利用したニンニンジャーの分裂を企て暗躍を開始する――。
　　果たしてニンニンジャーは再び世界の平和を守ることが出来るのか! ?